PCR Y qPCR PARA DETECCIÓN DE Aeromonas salmonicida Y Flavobacterium psychrophilum EN Oncorhynchus mykis

Abstract

Introducción. Entre los principales patógenos involucrados en infecciones de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) se incluyen las especies de bacterias Gram negativas como Aeromonas salmonicida y Flavobacterium psychrophilum. Estos son los agentes etiológicos de la forunculosis y de la enfermedad bacteriana de aguas frías respectivamente, que se caracterizan por la presencia de anorexia, letargia, septicemia, lesiones necróticas y hemorrágicas. Los métodos comunes de identificación de estas especies requieren largo tiempo y trabajo, y son difíciles de implementar por la variedad de perfiles bioquímicos y la ausencia de medios selectivos eficientes. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en tiempo real (qPCR) se han posicionado como importantes herramientas en la identificación de especies bacterianas por la especificidad de la reacción. Objetivo. Diseñar y evaluar protocolos de PCR y qPCR para la detección de A. salmonicida y F. psychrophilim en O. mykiss. Métodos. Se utilizaron como control las cepas registradas Flavobacterium psuchophilum ATCC®45510 y Aeromonas salmonicida ATCC®33658; y cepas control para pruebas de especificidad: Aeromonas hydrophila, A. caviae, Streptococcus agalactie, S. pneumoniea, S. mutans, S. iniae, S. pyogenes, y Edwardsiella tarda, las cuales fueron reconstituidas y cultivadas según las especificaciones para cada cepa.  Se realizó la extracción de DNA bacteriano mediante el equipo automatizado QIAcube utilizando el Kit comercial DNeasy® Blood & Tissue siguiendo el protocolo para extracción de DNA bacteriano. La concentración y pureza del DNA fue medida utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 y se verifico integridad del DNA por medio de electroforesis en gel de agarosa 1X. Cuatro secuencias de oligonucleótidos fueron sintetizadas. Para A. salmonicida fueron sintetizadas las secuencias Forward- 5'-CACACTGAGCCTGTTCCAGA-3', y Reverse- 5'-  AGTCAGCTCGCCAAACAGAT-3' a partir del gen fstB (AM712656.1) esperando un producto de 124 pb. Para F. psychrophilum Forward – 5´- AGACTCTATCGCAGCCGTTAC 3´  y Reverse - 5'-  GTCGTCGTCTGAATCCTCA 3´, a partir del gen gyrA (CAL42851.1); Esperando un producto amplificado de 175 pb. Las sondas utilizadas en la qPCR fueron marcadas con VIC y FAM como reporteros de amplificación. Las reacciones fueron llevadas a un volumen final de 25 µL conteniendo: >10 ng de DNA, 10X taq buffer, dNTPs (0,2 mM), primer forward (0,5 µM), Primer Reverse (0,5 µM), MgCl₂ (2,5 mM), taq polimerasa (1,25 U). Las reacciones fueron llevadas a cabo en el termociclador C1000 Touch™ Bio-Rad con el siguiente perfil térmico: 35 ciclos a 95°C por 30 segundos, 58°C por 30 segundos, y a 72°C por 30 s. Los productos amplificados por PCR fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Resultados. Se obtuvo una especificidad del 100% para cada par de “primers” evaluado con las cepas bacterianas de referencia. La concentración mínima de detección para ambos agentes fue en diluciones de 1:10000 tanto para PCR como para qPCR. Conclusión- Los resultados obtenidos demostraron que los protocolos diseñados y evaluados son específicos y sensibles para la detección de A. salmonicida y F. psychrophilum, convirtiéndolos en una herramienta diagnóstica de detección rápida y específica

Palabras clave: biología molecular, diagnostico, infección, patógeno, trucha arcoíris

PCR and qPCR FOR DETECTION OF Aeromonas salmonicida AND Flavobacterium psychrophilum in Oncorhynchus mykiss